腺病毒載體服務(wù)

服務(wù)項(xiàng)目簡介

腺病毒（Adenovirus）是目前高效可靠的重組病毒表達(dá)系統(tǒng)之一，可用于在哺乳細(xì)胞中瞬時(shí)及高水平地表達(dá)shRNA或目的蛋白。其具備以下you點(diǎn)：

1. 宿主范圍廣。腺病毒可感染一系列哺乳動物細(xì)胞，除可感染幾乎ALL人的細(xì)胞類型外，還可感染大鼠、小鼠、兔、豬、羊、猴、雞等物種細(xì)胞。
2. 因腺病毒的感染不依賴細(xì)胞周期，故其既可以感染增殖細(xì)胞也可以感染非增殖細(xì)胞。
3. 腺病毒具有嗜上皮細(xì)胞特性，因目前大多數(shù)腫瘤細(xì)胞均屬于上皮細(xì)胞，這使得腺病毒非常適合應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域。
4. 腺病毒滴度高，可用于動物水平的實(shí)驗(yàn)。
5. 有較好的生物安性。腺病毒攜帶的基因不會整合到宿主細(xì)胞基因組中；實(shí)驗(yàn)中雖然會有一定機(jī)率出現(xiàn)RCA（即復(fù)制型腺病毒），但由于大多數(shù)成人體內(nèi)都有針對腺病毒的抗體，一般情況下，危險(xiǎn)性不是很高。

技術(shù)路線

（一）常用腺病毒載體的包裝方法（包括病毒E1、E3缺陷）：

1. 經(jīng)典的同源重組法（雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染）：原理是HEK293細(xì)胞內(nèi)同源重組。

2. Ad-Easy法：通過同源臂重組的方式在細(xì)菌中獲得重組腺病毒基因組質(zhì)粒。

3. AdMax包裝系統(tǒng)：通過Cre/loxP獲得重組病毒，這個(gè)過程發(fā)生在HEK293細(xì)胞中，將克隆了外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用Cre/loxP系統(tǒng)的作用實(shí)現(xiàn)重組，產(chǎn)生重組腺病毒。

4. Ad5/F35MaxTM包裝系統(tǒng)： Ad5/F35是Ad5的病毒纖突（Fiber）被改造成35型腺病毒纖突的嵌合型腺病毒載體。對各種造血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的感染效率高于普通Ad5、外源基因表達(dá)量更多，包裝系統(tǒng)高效且穩(wěn)定，是目前方便快捷的腺病毒（Ad5/F35）包裝系統(tǒng)。

5. Ad5/F11包裝系統(tǒng)：Ad5/F11是Ad5的病毒fiber改造成為11型腺病毒的Fiber，te別針對血液細(xì)胞的感染，彌補(bǔ)Ad5的不足。

（二）構(gòu)建步驟：

1. 腺病毒載體構(gòu)建：將目的基因連入穿梭質(zhì)粒；

2. 病毒包裝、擴(kuò)增：
（1）將鑒定正確的基因克隆到慢病毒載體，與輔助載體一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行包裝；
（2）將包裝好的病毒超速離心收集；
（3）將濃縮病毒進(jìn)行滴定（TCID50法），滴定結(jié)果單位為IU/mL（一般為1011-1013IU/ml以上，根據(jù)客戶需要，不同量有價(jià)格差異）

3. 質(zhì)量控制與鑒定：
（1）測序鑒定；
（2）根據(jù)te定引物作RT-PCR鑒定；
（3）蛋白表達(dá)鑒定（根據(jù)客戶要求并由客戶提供高te異性抗體）

4. 技術(shù)步驟

構(gòu)建步驟

（1）將外源基因構(gòu)建至穿梭載體上。
（2）將穿梭載體與腺病毒骨架載體進(jìn)行LR體外重組。
（3）將重組成功的腺病毒載體線性化，轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，包裝腺病毒。
（4）將獲得的腺病毒感染HEK293細(xì)胞，繼續(xù)擴(kuò)增，以獲得更多的腺病毒。
（5）收獲腺病毒，提取其基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定，以確定所得腺病毒的正確性。

服務(wù)內(nèi)容

（1）表達(dá)shRNA用重組腺病毒包裝。
（2）基因過表達(dá)用重組腺病毒包裝。

應(yīng)用領(lǐng)域

基因治療，基因組學(xué)，RNAi等。

服務(wù)周期

總計(jì)需要50-70個(gè)工作日內(nèi)，得到1011-1013VP的高純度病毒。

客戶須知（對材料的要求、注意事項(xiàng)）

（1）大插入片段5kb-8Kb，插入片段的長度不同，技術(shù)難度也不同；

（2）本公司提供的病毒量為≥109；

（3）提供詳盡、完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

附：腺病毒和慢病毒比較表

服務(wù)咨詢及技術(shù)支持

電話:

Email:slby800@163.com