原位末端凋亡法(TUNEL)技術(shù)服務(wù)

服務(wù)項(xiàng)目簡(jiǎn)介

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) (TUNEL Apoptosis Assay)是一種高靈敏度又快速簡(jiǎn)便的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法。對(duì)于待檢測(cè)的細(xì)胞或組織樣品，經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記和后續(xù)的DAB顯色等步驟，即可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到凋亡細(xì)胞。

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder。

基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)標(biāo)記的dUTP(Biotin-dUTP)，隨后和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結(jié)合，后在HRP的催化下通過(guò)DAB顯色來(lái)顯示凋亡細(xì)胞，從而可以通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)到凋亡的細(xì)胞。

技術(shù)步驟

1. 材料與試劑 (以Promega試劑盒為例)，包括：

(1)生物素標(biāo)記的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標(biāo)記的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) 1 nmol/μL

(2)TdT酶（25U/μL）

(3)反應(yīng)緩沖液

(4)洗滌緩沖液

(5)異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的親合素或鏈霉親合素（2.5μg/mL）或抗地高辛抗體（1︰30）

(6)PI染液（含PI 5μg/mL及無(wú)DNA酶活性的RNA酶0.1%）

(7)PBS緩沖液

(8)塑料蓋玻片

2. 樣品

(1)懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的甩片或涂片

(2)貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞

(3)冰凍切片

(4)常規(guī)石蠟切片

3. 操作方法

(1)固定：培養(yǎng)細(xì)胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常規(guī)4%中性福爾馬林固定、石蠟包埋之切片進(jìn)行脫蠟、水化。

(2)洗滌：玻片浸入PBS緩沖液，搖床上洗滌5min，三次。

(3)反應(yīng)：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細(xì)胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加反應(yīng)液（每50μL反應(yīng)液含TdT酶0.5μL,標(biāo)記的-dUTP 1μL），使反應(yīng)液均勻地覆蓋于ALL細(xì)胞或組織切片上，蓋上塑料蓋玻片，置濕盒中，37℃孵育1h。

(4)終止反應(yīng)：去掉塑料蓋玻片，將玻片置盛有洗滌緩沖液的染色缸內(nèi)，洗滌兩次，每次5min。

(5)FITC標(biāo)記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細(xì)胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加FITC反應(yīng)液（含F(xiàn)ITC 2.5μg/mL），室溫下避光孵育10min。

(6)洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內(nèi)，洗兩次，每次5min。

(7)PI復(fù)染：將玻片置于盛有PI染液的染色缸內(nèi)，室溫下避光染色30min。

(8)封片：用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上，亦可用無(wú)色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，盡早鏡檢觀察。

4. 結(jié)果判定：用熒光顯微鏡觀察，選用藍(lán)色激發(fā)光（波長(zhǎng)488nm），ALL的細(xì)胞核均被PI著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細(xì)胞被te異地標(biāo)記上FITC，顯示出黃綠色熒光。

應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞凋亡(apoptosis)的分析方法，細(xì)胞凋亡有一項(xiàng)重要的特征為細(xì)胞內(nèi)的DNA會(huì)碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探測(cè)DNA片段的產(chǎn)生。

服務(wù)周期

交貨時(shí)間： 15~20天

客戶須知（對(duì)材料的要求、注意事項(xiàng)）

結(jié)果提供： 正常和陽(yáng)性對(duì)照玻片及其1張數(shù)碼照片，剩余石蠟塊，檢測(cè)報(bào)告；

樣本要求：取材保持組織新鮮（組織塊以小于2cm×1.5cm×0.3cm為宜），立即放入固定液（固定液用10%福爾馬林液或4%多聚甲醛緩沖液，體積為組織塊的10倍以上）中，避免干燥；對(duì)于有血跡的樣本，可用PBS液或生理鹽水沖洗后直接放入固定液中；經(jīng)固定后的樣本必須在48小時(shí)內(nèi)處理。

服務(wù)咨詢及技術(shù)支持