俄亥俄州立大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院的James Lee課題組發(fā)明了一種細(xì)胞納米化生物芯片，在數(shù)量級(jí)上提高外泌體生產(chǎn)和核酸包載效率，在靶向性和療效上大大超越目前臨床實(shí)驗(yàn)正在測(cè)試的外泌體包載的基因治療藥物！這些結(jié)果12月16日發(fā)表在《Nature Biomedical Engineering》上。

外泌體是細(xì)胞內(nèi)的多囊體分泌到細(xì)胞外，半徑為40-150 nm的囊泡，在生理狀態(tài)下介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。作為基因治療中的核酸載體，外泌體的生物相容性好，其膜上天然表達(dá)跨膜和膜錨定蛋白，因此具有體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)以及跨血腦和血腫瘤屏障的優(yōu)點(diǎn)。Nature曾在2017年報(bào)道外泌體的胰腺癌靶向治療作用。然而，僅有特定種類的細(xì)胞能夠分泌外泌體，且具有產(chǎn)量稀少、核酸包載量低、靶向修飾難度大等缺點(diǎn)。

因此，研究者們發(fā)明了一種新的細(xì)胞納米穿孔（cell nanoporation， CNP） 生物芯片：在密布直徑500nm納米孔道的芯片上培養(yǎng)單層的來源細(xì)胞（如鼠的成纖維細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞），將整個(gè)裝置孵育在目標(biāo)質(zhì)粒DNA的緩沖液中，給予定向電流后，細(xì)胞膜受到損傷，帶負(fù)電的核酸質(zhì)粒順著電勢(shì)差從納米孔道中進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

此后，細(xì)胞開始修復(fù)膜并將目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄為mRNA，同時(shí)大量分泌外泌體，以排出電流強(qiáng)制注入的外來質(zhì)粒。然而，細(xì)胞不斷拋出體外的“廢物”正是研究者所需的包含目標(biāo)mRNA的外泌體。外泌體分泌活動(dòng)在電穿孔8h后達(dá)到峰值，并能持續(xù)24h以上。與傳統(tǒng)的電穿孔（bulk electroporation）相比，CNP大大提高了外泌體產(chǎn)量，并將其中mRNA的載藥量提高1000倍！

CNP法生產(chǎn)負(fù)載目標(biāo)mRNA的外泌體

對(duì)于CNP觸發(fā)外泌體釋放的機(jī)制，研究者認(rèn)為與納米電穿孔導(dǎo)致的細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流有關(guān)，因?yàn)榧?xì)胞為鈣離子螯合劑EGTA能夠減少外泌體的釋放。并且，他們觀察到納米電流通道附近溫度身高，熱休克蛋白含量增加后激活p53-TSAP信號(hào)通路，從而促進(jìn)外泌體釋放。

CNP觸發(fā)外泌體釋放的機(jī)制

研究者在外泌體膜表面富集的跨膜蛋白CD47末端克隆神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向肽，用CNP技術(shù)在其中包載抑癌基因PTEN， 重新啟動(dòng)突變的抑癌開關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)PTEN缺陷型人U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和小鼠GL261膠質(zhì)瘤模型對(duì)CD47外泌體（Exo-T）對(duì)攝取顯著增加。

進(jìn)一步評(píng)估藥代動(dòng)力學(xué)，研究者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CD47的Exo-T在體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)三倍，說明Exo-T在體內(nèi)具有高度穩(wěn)定性，能夠進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)程的循環(huán)。提示Exo-T給藥后維持有效的周期顯著延長(zhǎng)，可減小臨床用藥頻率。

最后，研究者對(duì)Exo-T的體內(nèi)療效進(jìn)行評(píng)估，較非靶向外泌體和TurboFect納米載體，其穿透血腦屏障、靶向腫瘤富集的能力更強(qiáng)，肝臟和脾臟等其他器官的蓄積顯著更低。實(shí)驗(yàn)組小鼠的平均生存時(shí)間為造膜后49天，較對(duì)照組的37天顯著延長(zhǎng)。

CNP法制備的CD47外泌體的U87膠質(zhì)瘤鼠體內(nèi)靶向性和療效

Zhaogang Yang等人發(fā)明的細(xì)胞納米穿孔法，顛覆傳統(tǒng)先純化后載藥的外泌體制備方法，巧妙利用納米電穿孔將兩步驟合二為一，使細(xì)胞分泌的負(fù)載目標(biāo)mRNA的外泌體，同時(shí)極大改善其產(chǎn)量、靶向性和適用性。目前，傳統(tǒng)電穿孔法附載短干擾RNA的外泌體臨床實(shí)驗(yàn)已在進(jìn)行當(dāng)中，而CNP技術(shù)展現(xiàn)出的高靶向、低毒性的數(shù)量級(jí)突破，提示更優(yōu)異的外泌體基因治療策略在臨床廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)化可能性。(生物谷Bioon.com）

小編推薦會(huì)議  2020（第五屆）外泌體與疾病研討會(huì)

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