嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞（CAR-T）療法是革命性的，因為它已經(jīng)產(chǎn)生了非常有效和持久的臨床反應(yīng)。CAR是一種工程化的合成受體，其功能是重新引導(dǎo)淋巴細(xì)胞（最常見的是T細(xì)胞）識別和消除表達(dá)特定靶抗原的細(xì)胞。CAR與細(xì)胞表面上表達(dá)的靶抗原的結(jié)合不依賴于MHC受體，從而導(dǎo)致強(qiáng)有力的T細(xì)胞活化和強(qiáng)大的抗腫瘤反應(yīng)?？笴D19 CAR-T細(xì)胞療法治療B細(xì)胞惡性腫瘤的空前成功導(dǎo)致它在2017年被美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)上市。然而，CAR-T細(xì)胞療法仍有重大的局限性必須解決，包括危及生命的CAR-T細(xì)胞相關(guān)毒性，對實體瘤的療效有限，B細(xì)胞惡性腫瘤中的抑制和抵抗性，抗原逃逸，有限的持久性，較差的遷移和腫瘤浸潤，以及免疫抑制性微環(huán)境。此外，技術(shù)人員必須適應(yīng)這個不斷增長和發(fā)展的領(lǐng)域的需要，為此需要制定教育計劃來培訓(xùn)他們。

人們已經(jīng)提出許多方法，包括將CAR-T細(xì)胞療法與其他抗癌療法相結(jié)合，或采用創(chuàng)新的CAR工程策略，以提高抗腫瘤療效，擴(kuò)大臨床療效，并限制毒性。在這篇綜述文章中，美國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的Robert C. Sterner和梅奧診所的Rosalie M. Sterner討論了CAR-T細(xì)胞工程的最新創(chuàng)新，以提高對血液惡性腫瘤和實體瘤的臨床療效，以及克服當(dāng)前存在的包括抗原逃逸、CAR-T細(xì)胞遷移、腫瘤浸潤、免疫抑制性微環(huán)境和CAR-T細(xì)胞相關(guān)毒性在內(nèi)的局限性的策略（圖1）。

圖1.CAR-T細(xì)胞療法的局限性。圖片來自Blood Cancer Journal, 2021, doi:10.1038/s41408-021-00459-7。

CAR結(jié)構(gòu)

CAR是模塊化的合成受體，主要由四個部分組成：(1)一個細(xì)胞外靶抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（extracellular target antigen-binding domain）；(2)一個鉸鏈區(qū)（hinge region），(3)一個跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain）；(4)一個或多個細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（intracellular signaling domain）。本文中，這兩名作者將討論目前CAR設(shè)計的基本原則。

（1）抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域是CAR中賦予靶抗原特異性的部分。歷史上，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域來源于單克隆抗體的可變重鏈（VH）和輕鏈（VL），通一個柔性的連接物連接VH和VL可形成單鏈可變片段（scFv）。通常而言，存在于CAR中的scFv靶向細(xì)胞外表面癌癥抗原，導(dǎo)致不依賴于主要組織相容性復(fù)合體（MHC）的T細(xì)胞活化，盡管使用MHC依賴性的模擬T細(xì)胞受體（TCR）的 CAR識別細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原已經(jīng)被描述。除了簡單地識別和結(jié)合靶表位之外，scFv的幾個特點(diǎn)影響CAR功能。比如，VH和VL鏈之間的相互作用模式，以及互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR）的相對位置影響CAR對其靶表位的親和力和特異性。親和力是抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個特別重要的參數(shù)，因為它從根本上決定了CAR的功能。為了識別腫瘤細(xì)胞表面上的抗原、誘導(dǎo)CAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并激活T細(xì)胞，CAR的抗原結(jié)合親和力必須足夠高，但不能高到足以導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞遭受激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并引發(fā)毒性。雖然親和力肯定是使問題進(jìn)一步復(fù)雜化的最重要因素之一，但已有研究表明，即使具有相似親和力的scFv也可以差異性地影響CAR-T細(xì)胞功能。因此，為了優(yōu)化CAR與靶抗原的結(jié)合，必須考慮其他因素，如表位位置，靶抗原密度，以及避免使用與配體無關(guān)的補(bǔ)強(qiáng)信號（tonic signaling）相關(guān)的scFv。

抗原結(jié)合位點(diǎn)空間示意圖，圖片來自FEBS Journal, 2011, doi:10.1111/j.1742-4658.2011.08207.x。

（2）鉸鏈區(qū)。鉸鏈或間隔區(qū)被定義為從跨膜結(jié)構(gòu)域延伸結(jié)合單元的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)區(qū)域。鉸鏈區(qū)的功能是提供靈活性，以克服空間阻礙，并對CAR的長度有貢獻(xiàn)，以便允許抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域接觸到靶表位。重要的是，所選擇的鉸鏈區(qū)似乎影響CAR的功能，因為鉸鏈區(qū)的長度和組成的差異可以影響靈活性、CAR表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、表位識別、激活輸出的強(qiáng)度和表位識別。除了這些影響之外，已經(jīng)人提出，鉸鏈區(qū)長度對于提供足夠的細(xì)胞間距離以形成免疫突觸是至關(guān)重要的。原則上，“最佳”鉸鏈區(qū)長度取決于目標(biāo)細(xì)胞上的靶表位位置和空間阻礙水平：長的鉸鏈區(qū)提供增加的靈活性，并允許更有效地接觸到膜近端表位或復(fù)雜的糖基化抗原，而短的鉸鏈區(qū)更成功地結(jié)合膜遠(yuǎn)端表位。然而，在實踐中，合適的鉸鏈區(qū)長度往往是經(jīng)驗性確定的，必須為每對特定的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域定制。文獻(xiàn)中有許多例子，比如短間隔CAR[CD19和癌胚抗原（CEA）]和長間隔CAR[粘蛋白1（MUC1），受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1（ROR1）的膜近端表位]。最常用的鉸鏈區(qū)來自CD8，CD28，IgG1或IgG4的氨基酸序列。然而，源自IgG的鉸鏈區(qū)可以導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞耗竭，從而降低在體內(nèi)的持久性，因為它們可以與Fcγ受體相互作用。這些影響可以通過選擇不同的間隔區(qū)或通過基于功能或結(jié)構(gòu)的考慮對間隔區(qū)進(jìn)行進(jìn)一步的改造來避免。

（3）跨膜結(jié)構(gòu)域。在CAR的所有組件中，跨膜結(jié)構(gòu)域可能是最少被表征的區(qū)域。跨膜結(jié)構(gòu)域的主要功能是將CAR錨定在T細(xì)胞膜上，盡管有證據(jù)表明，跨膜結(jié)構(gòu)域也可以與CAR-T細(xì)胞功能相關(guān)。更具體地說，有研究表明，CAR跨膜結(jié)構(gòu)域影響CAR的表達(dá)水平和穩(wěn)定性，活躍于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或突觸形成過程中，并與內(nèi)源性信號分子二聚化。大多數(shù)跨膜結(jié)構(gòu)域來自天然蛋白，包括CD3ζ、CD4、CD8α或CD28。不同跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)AR功能的影響沒有得到很好的研究，這是因為跨膜結(jié)構(gòu)域經(jīng)常根據(jù)細(xì)胞外間隔區(qū)或細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的要求而改變。

值得注意的是，CD3ζ跨膜結(jié)構(gòu)域可能促進(jìn)CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞激活，因為CD3ζ跨膜結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)CAR二聚化和整入內(nèi)源性TCR中。與具有CD28跨膜結(jié)構(gòu)域的CAR相比，CD3ζ跨膜結(jié)構(gòu)域的這些有益影響是以降低CAR穩(wěn)定性為代價的?？缒そY(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)似乎也影響CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生和激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD），這是因為與具有來自CD28的跨膜結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的CAR相比，具有CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的CAR-T細(xì)胞釋放的TNF和IFNγ的數(shù)量減少，對AICD的敏感性降低?？偟膩碚f，有研究表明，將近端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)的跨膜結(jié)構(gòu)域連接在一起，可能最能促進(jìn)CAR-T細(xì)胞信號的正確傳遞，而使用常用的CD8α或CD28跨膜結(jié)構(gòu)域可能會增強(qiáng)CAR的表達(dá)和穩(wěn)定性。

（4）細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。可以說，在CAR工程中最受關(guān)注的是了解CAR共刺激的效果，目標(biāo)是生成具有最佳胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR構(gòu)建體。在20世紀(jì)90年代后期設(shè)計出的第一代CAR包含CD3ζ或FcRγ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。絕大多數(shù)CAR依賴于通過CD3ζ衍生性免疫受體酪氨酸激活基序來激活CAR-T細(xì)胞。然而，有效的T細(xì)胞反應(yīng)是不能夠僅通過這些激活基序的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生。這些第一代CAR的持久性在體外并不強(qiáng)勁。這些發(fā)現(xiàn)得到了顯示出有限或沒有療效的臨床研究的呼應(yīng)。

CC49-ζ 載體圖，圖片來自J Immunother Cancer, 2017, doi:10.1186/s40425-017-0222-9。

使用B細(xì)胞惡性腫瘤的早期體內(nèi)模型證實了共刺激在靶向CD-19的CAR-T細(xì)胞持久性方面的重要性。通過添加共刺激結(jié)構(gòu)域，重復(fù)抗原暴露后的IL-2產(chǎn)生和細(xì)胞增殖得到了改善。隨著對共刺激對持久性CAR-T細(xì)胞療法的重要性的理解，人們構(gòu)建出具有一個與CD3ζ細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)的共刺激結(jié)構(gòu)域的第二代CAR。兩個最常見的獲得FDA批準(zhǔn)的共刺激結(jié)構(gòu)域CD28和4-1BB（CD137）都與較高的患者反應(yīng)率相關(guān)。這兩種共刺激結(jié)構(gòu)域的功能和代謝譜不同：具有CD28結(jié)構(gòu)域的CAR-T細(xì)胞分化為效應(yīng)記憶T細(xì)胞，主要使用有氧糖酵解，而具有4-1BB結(jié)構(gòu)域的CAR-T細(xì)胞分化為中樞記憶T細(xì)胞，并顯示出增加的線粒體生物生成和氧化代謝。

臨床上，第二代CAR-T細(xì)胞在一些血液惡性腫瘤中產(chǎn)生了強(qiáng)烈的治療反應(yīng)，包括慢性淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。目前正在研究第二代CAR-T細(xì)胞在實體瘤中的療效，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、晚期肉瘤、肝轉(zhuǎn)移瘤以及間皮瘤、卵巢癌和胰腺癌。幾種替代性共刺激結(jié)構(gòu)域，如誘導(dǎo)性T細(xì)胞共刺激物（ICOS）、CD27、MYD88、CD40和OX40（CD134）已顯示出臨床前的療效，盡管臨床研究仍有待進(jìn)行。據(jù)推測，僅通過一個結(jié)構(gòu)域的共刺激產(chǎn)生不完全的激活，這導(dǎo)致了第三代CAR的產(chǎn)生。第三代CAR整入兩個與CD3ζ串聯(lián)的共刺激結(jié)構(gòu)域。第三代CAR的臨床前研究產(chǎn)生了好壞參半的結(jié)果。具體來說，整入CD28和4-1BB信號的CAR在淋巴瘤中導(dǎo)致更強(qiáng)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，與第二代CAR相比，它們在肺轉(zhuǎn)移瘤中顯示出更好的體內(nèi)抗腫瘤反應(yīng)。在白血病和胰腺癌模型中，第三代CAR沒有顯示出體內(nèi)治療優(yōu)勢，并且在各自的模型中未能優(yōu)于第二代CAR。

CAR-T細(xì)胞治療的局限性

（1）抗原逃逸。CAR-T細(xì)胞療法最具挑戰(zhàn)性的局限性之一是腫瘤對單抗原靶向CAR（即靶向單抗原的CAR）構(gòu)建體產(chǎn)生抵抗性。雖然最初的單抗原靶向CAR-T細(xì)胞可以提供高反應(yīng)率，但在接受這些CAR-T細(xì)胞治療的患者中，相當(dāng)一部分患者的惡性細(xì)胞表現(xiàn)出部分或完全喪失靶抗原表達(dá)。這種現(xiàn)象稱為抗原逃逸。例如，盡管70%～90%的復(fù)發(fā)和/或難治性ALL患者對CD19靶向CAR-T細(xì)胞治療表現(xiàn)出持久的反應(yīng)，但最近的隨訪數(shù)據(jù)表明，存在一種常見的疾病抵抗性機(jī)制，包括30%～70%的在治療后有復(fù)發(fā)疾病的患者出現(xiàn)CD19抗原下調(diào)/喪失。類似地，在正在接受BCMA靶向CAR-T細(xì)胞治療的多發(fā)性骨髓瘤患者中，BCMA表達(dá)的下調(diào)或喪失已被觀察到。類似的抗原逃逸抵抗性模式已在實體瘤中觀察到。比如，靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中IL13Ra2的CAR-T細(xì)胞治療病例報告表明，腫瘤復(fù)發(fā)時IL13Ra2表達(dá)減少。

為了降低CAR-T細(xì)胞治療血液惡性腫瘤和實體瘤的復(fù)發(fā)率，現(xiàn)在許多策略都依賴于靶向多種抗原。這些策略都采用了雙CAR構(gòu)建體或串聯(lián)CAR的方法，串聯(lián)CAR是指含有兩個scFv的單個CAR構(gòu)建體，以便同時靶向多種腫瘤靶抗原。從臨床上來看，這兩種策略都可能導(dǎo)致長期持久的緩解率，目前已有多項針對CD19和CD20或CD19和CD22的臨床試驗。令人振奮的是，使用雙靶向CAR-T細(xì)胞（CD19/CD22或CD19/BCMA）的臨床試驗的初步結(jié)果顯示了有希望的結(jié)果。更具體地說，CD19/CD22 CAR-T細(xì)胞療法的初步臨床試驗結(jié)果在ALL和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤成人患者中表現(xiàn)出了良好的療效。此外，BCMA/CD19靶向CAR-T細(xì)胞治療多發(fā)性骨髓瘤的初步結(jié)果表明，BCMA/CD19靶向CAR具有較高的療效和良好的安全性。在實體瘤中，已經(jīng)在臨床前模型中測試了幾種串聯(lián)CAR，包括靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的HER2和IL13Ra2的串聯(lián)CAR以及靶向乳腺癌中的HER2和MUC1的串聯(lián)CAR。在這兩種情況下，相比于單靶向療法，雙重靶向?qū)е铝藘?yōu)越的抗腫瘤反應(yīng)。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤研究中，與其他兩種雙靶向療法相比，靶向HER2和IL13Ra2的串聯(lián)CAR導(dǎo)致抗腫瘤活性改善，抗原逃逸減少。這項研究說明了優(yōu)化選擇靶抗原的重要性，這不僅可以提高抗腫瘤反應(yīng)，還可以減少抗原逃逸，防止復(fù)發(fā)。

（2）非腫瘤組織的在靶效應(yīng)（On-target off-tumor effects，以下簡稱脫靶效應(yīng)）。靶向?qū)嶓w瘤抗原的挑戰(zhàn)之一是，實體瘤抗原通常也在正常組織中以不同水平表達(dá)。因此，抗原選擇在CAR設(shè)計中至關(guān)重要，不僅能保證治療效果，還能限制脫靶毒性。克服靶向也存在于正常組織中的實體腫瘤抗原的一個潛在途徑是靶向僅限于腫瘤的翻譯后修飾，如實體瘤過表達(dá)的截短O -聚糖，比如Tn（GalNAca1-O-Ser/Thr）和sialyl-Tn（STn）（NeuAca2–6-GalNAca1-O-Ser/Thr）。四個主要的CAR-T細(xì)胞靶標(biāo)已被研究，包括TAG7228，B7-H3，MUC1和MUC16。雖然第一代靶向結(jié)直腸癌中TAG72的CAR-T細(xì)胞沒有產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)，但目前正在研究第二代TAG72-CAR-T細(xì)胞的新版本和其他腫瘤限制性翻譯后修飾。為了擴(kuò)大CAR-T細(xì)胞療法在血液惡性腫瘤和實體瘤中的臨床應(yīng)用，進(jìn)一步開發(fā)創(chuàng)新策略以減少抗原逃逸和選擇能夠誘導(dǎo)足夠的抗腫瘤療效的抗原，同時將毒副作用降到最低將是必要的。

靶向B7-H3的CAR-T細(xì)胞，圖片來自Cancer Cell, 2019, doi:10.1016/j.ccell.2019.01.002。

（3）CAR-T細(xì)胞的遷移和腫瘤浸潤。與血液惡性腫瘤相比，實體瘤CAR-T細(xì)胞治療受限于CAR-T細(xì)胞向?qū)嶓w瘤遷移和浸潤的能力，因為免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境和物理性的腫瘤屏障，如腫瘤基質(zhì)，限制了CAR-T細(xì)胞的滲透和遷移。改善這些局限性的一個策略是利用除全身給送以外的給送途徑，這是因為局部給送（1）消除了CAR-T細(xì)胞向疾病部位遷移的需要，（2）限制了脫靶毒性，畢竟CAR-T細(xì)胞的在靶活性是針對腫瘤細(xì)胞的，從而最大限度地減少它們與正常組織的相互作用。臨床前模型已經(jīng)證明，在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，靶向HER2的CAR-T細(xì)胞和靶向IL13Ra2的CAR-T細(xì)胞的靜脈注射具有卓越的治療效果。這些研究已經(jīng)導(dǎo)致了三項正在進(jìn)行的臨床試驗，這三項臨床試驗分別針對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（NCT02208362，NCT03389230）和復(fù)發(fā)性腦或柔腦膜轉(zhuǎn)移（NCT03696030）進(jìn)行CAR-T細(xì)胞的靜脈注射。同樣，臨床前模型顯示，通過胸膜內(nèi)注射CAR-T細(xì)胞治療惡性胸膜間皮瘤具有優(yōu)越性，這已經(jīng)導(dǎo)致了一項正在進(jìn)行的1期臨床試驗（NCT02414269）。雖然局部注射似乎有較好的療效，但理論上這種方法僅限于單個腫瘤病灶/寡轉(zhuǎn)移性疾病（oligometastatic disease）。

最近開發(fā)的一種策略似乎可以顯著改善CAR-T細(xì)胞的遷移，涉及在CAR-T細(xì)胞表面上表達(dá)趨化因子受體，以匹配和響應(yīng)腫瘤源性趨化因子。例如，最近的研究表明，經(jīng)基因修飾后表達(dá)CXCR2的整合素αvβ6-CAR-T細(xì)胞或過度表達(dá)CXCR1或CXCR2的CAR-T細(xì)胞都增強(qiáng)了遷移和顯著提高抗腫瘤療效。腫瘤基質(zhì)等物理屏障也限制了CAR-T細(xì)胞療法，這是因為這些物理屏障阻止了對腫瘤的滲透。腫瘤基質(zhì)主要由細(xì)胞外基質(zhì)組成，而在細(xì)胞外基質(zhì)中，硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）是CAR-T細(xì)胞必須降解從而進(jìn)入腫瘤的主要成分。經(jīng)過基因改造后表達(dá)降解HSPG的乙酰肝素酶（heparanase）的CAR-T細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的腫瘤浸潤和抗腫瘤活性。同樣，靶向成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）的CAR-T細(xì)胞在動物模型中通過減少腫瘤成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出增加的細(xì)胞毒性功能。在未來，有必要開發(fā)創(chuàng)新的遞送策略和方法，以提高腫瘤滲透，以便將治療效果擴(kuò)大到復(fù)雜的實體瘤和轉(zhuǎn)移瘤。

（4）免疫抑制性微環(huán)境。在腫瘤微環(huán)境中，許多驅(qū)動免疫抑制的細(xì)胞類型可以浸潤實體瘤，包括骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）。這些腫瘤浸潤細(xì)胞驅(qū)動腫瘤促進(jìn)細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子的產(chǎn)生。此外，免疫檢查點(diǎn)途徑，如PD-1或CTLA-4，可用于降低抗腫瘤免疫。對CAR-T細(xì)胞治療無反應(yīng)或反應(yīng)較弱的主要原因之一是T細(xì)胞擴(kuò)增較差和T細(xì)胞的短期持續(xù)存在。據(jù)推測，這種T細(xì)胞功能衰竭的產(chǎn)生由共同抑制途徑觸發(fā)。因此，CAR-T細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)阻斷的聯(lián)合免疫治療被認(rèn)為是下一個免疫治療的前沿，因為它提供了強(qiáng)大免疫反應(yīng)所必需的兩個要素：（1）浸潤腫瘤的CAR-T細(xì)胞；（2）PD-1/PD-L1阻斷，可確保維持T細(xì)胞的持久性和功能。在血液惡性腫瘤中，在賓州兒童醫(yī)院的一項單中心研究中，對14名事先接受大量治療的B-ALL兒童進(jìn)行PD-1阻斷和CD19 CAR-T細(xì)胞聯(lián)合治療，改善了CAR-T細(xì)胞的持久性和實現(xiàn)了更好的臨床結(jié)果。在實體瘤中，目前有許多研究旨在評估這類聯(lián)合治療的反應(yīng)率。在一項耐人尋味的研究中，11名間皮瘤患者在接受環(huán)磷酰胺預(yù)處理后，再接受單劑量的間皮素靶向CAR-T細(xì)胞和至少三劑抗PD-1藥物，結(jié)果實現(xiàn)72%的反應(yīng)率和兩名患者的完全代謝反應(yīng)。結(jié)合其他形式的免疫治療策略可能仍然是必要的，以便對抗存在于腫瘤微環(huán)境中的抑制信號。

最近的研究工作集中在對不友好的腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制因子（比如TGF β介導(dǎo)的抑制信號）有抵抗力的CAR基因改造上。另一個有趣的策略涉及對CAR-T細(xì)胞進(jìn)行基因改造，以刺激性細(xì)胞因子的形式提供免疫刺激信號，增加T細(xì)胞的生存、增殖、抗腫瘤活性，并重新平衡腫瘤微環(huán)境。許多研究已經(jīng)探究了許多細(xì)胞因子來創(chuàng)建這些“裝甲CAR（armored CAR）”。關(guān)注促炎細(xì)胞因子的表達(dá)而不是關(guān)注抑制信號的研究依賴于IL-12分泌、IL-15表達(dá)，以及將免疫抑制性細(xì)胞因子（如IL-4）信號重新引向促炎細(xì)胞因子。

雖然免疫檢查點(diǎn)阻斷-CAR-T細(xì)胞聯(lián)合療法很可能是一種新的免疫治療選擇，但也要認(rèn)識到，即使這種組合可能仍然不足以誘導(dǎo)T細(xì)胞的浸潤和效應(yīng)功能。因此，將CAR-T細(xì)胞療法和免疫檢查點(diǎn)阻斷與其他免疫療法/策略相結(jié)合的額外研究可能是實現(xiàn)T細(xì)胞在復(fù)雜血液惡性腫瘤或?qū)嶓w瘤中的浸潤和效應(yīng)功能所必需的。

（5）CAR-T細(xì)胞相關(guān)毒性。雖然CAR-T細(xì)胞療法已經(jīng)是一種革命性的癌癥治療工具，但較高的毒副作用率與一些死亡阻止了CAR-T細(xì)胞療法成為一線治療。可能決定細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）、嗜血細(xì)胞綜合征（HLH）/巨噬細(xì)胞活化綜合征（MAS）和/或免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS）發(fā)生率和嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素是CAR的設(shè)計、特定靶點(diǎn)和腫瘤類型。到目前為止，CAR-T細(xì)胞療法的毒性已經(jīng)在接受獲得FDA批準(zhǔn)的第一個CAR-T細(xì)胞療法---靶向CD19的CAR-T細(xì)胞---的患者中得到了最廣泛的描述。即使在反應(yīng)率最高的臨床試驗中，患者也會發(fā)生嚴(yán)重的危及生命的事件。具體來說，在急性淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤（ALL/LBL）患者接受CAR-T細(xì)胞治療的情況下，幾乎所有的患者都有至少一些不太嚴(yán)重的毒性表現(xiàn)，而23%～46%的患者表現(xiàn)出嚴(yán)重的超生理細(xì)胞因子的產(chǎn)生和大量的體內(nèi)T細(xì)胞增殖。這些毒性水平的全身細(xì)胞因子釋放和部分患者出現(xiàn)的嚴(yán)重的免疫細(xì)胞交叉激活導(dǎo)致以下毒性：（1）CRS，它與超生理細(xì)胞因子的產(chǎn)生和大量體內(nèi)T細(xì)胞增殖有關(guān)；（2）HLH/MAS，它被定義為一種嚴(yán)重的高炎癥綜合征，其特征是CRS、血清鐵蛋白升高和噬血細(xì)胞增多、腎功能衰竭、肝酶、脾腫大、肺水腫和/或自然殺傷（NK）細(xì)胞活性缺失；（3）ICANS，其特征是腦脊液細(xì)胞因子水平升高和血腦屏障破壞。

從機(jī)制上講，CRS是由于給送的CAR-T細(xì)胞被廣泛激活，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子的釋放。輕度CRS的臨床表現(xiàn)是發(fā)熱，伴有疲乏、腹瀉、頭痛、皮疹、關(guān)節(jié)痛和肌痛，在更嚴(yán)重的情況下，患者可能會出現(xiàn)低血壓、心臟功能障礙、循環(huán)衰竭、呼吸衰竭、腎功能衰竭、多器官系統(tǒng)衰竭，并有可能進(jìn)展到死亡?？偟膩碚f，77%～93%的接受CAR-T細(xì)胞治療的白血病患者和37%～93%的接受CAR-T細(xì)胞治療的淋巴瘤患者有任何一種級別的CRS，而用tisagenlecleucel治療復(fù)發(fā)/難治性B-ALL的患者中46%的人和用axicabtagene ciloleucel和tisagenlecleucel治療彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的患者中13%～18%的人表現(xiàn)出≥3級CRS。在病理生理學(xué)上，CRS被認(rèn)為主要是由IL-6介導(dǎo)的，因此，CRS管理依賴于使用托珠單抗和皮質(zhì)類固醇來阻斷IL-6受體。即使使用FDA批準(zhǔn)用來治療重度CRS的托珠單抗，重度CRS和死亡仍然發(fā)生。

有趣的是，CAR-T細(xì)胞治療后的HLH/MAS對IL-6抑制產(chǎn)生抵抗性，可能需要化療。雖然由于與高級別CRS重疊，CAR-T細(xì)胞治療后的HLH/MAS發(fā)生率尚不清楚，但在大約1%的接受CAR-T細(xì)胞治療的患者中已有報道。在神經(jīng)毒性的情況下，潛在的病理生理學(xué)和機(jī)制尚不完全清楚。ICANS的臨床表現(xiàn)范圍從精神錯亂、頭痛、注意力障礙、尋字困難、局灶性神經(jīng)功能障礙或腦病到危及生命的腦水腫、短暫性昏迷或癲癇發(fā)作。CAR-T細(xì)胞治療后的神經(jīng)毒性相對較為常見，在接受治療的白血病患者和淋巴瘤患者中，分別有高達(dá)67%和62%的人發(fā)生神經(jīng)毒性。對神經(jīng)毒性的管理集中在皮質(zhì)類固醇，因為IL-6抑制劑通常對CAR-T細(xì)胞治療相關(guān)的神經(jīng)毒性無效。到目前為止，仍然沒有批準(zhǔn)的療法來預(yù)防上述毒性，這就使得優(yōu)化CAR設(shè)計和采用其他策略來減少CAR誘導(dǎo)的毒性至關(guān)重要。下面，這些作者回顧了在CAR設(shè)計中的經(jīng)驗教訓(xùn)以減少毒性，以及采取的額外策略，以緩解CAR-T細(xì)胞療法中的毒性。

針對CAR-T細(xì)胞的局限性采取的應(yīng)對策略

為了達(dá)到有效的治療反應(yīng)，CAR-T細(xì)胞的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域必須結(jié)合它的靶表位，并達(dá)到最低閾值水平，以誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞激活和細(xì)胞因子分泌。但與此同時，也存在一定的激活閾值水平，當(dāng)超過該閾值水平時，會產(chǎn)生毒性水平的細(xì)胞因子和免疫系統(tǒng)激活。換句話說，CAR-T細(xì)胞必須保持在其治療窗口內(nèi)才能發(fā)揮臨床療效，因為超過治療窗口將導(dǎo)致毒性。從基因改造的角度來看，CAR-T細(xì)胞的激活程度和激活動力學(xué)受到幾個因素的影響，包括但不限于惡性細(xì)胞表面上表達(dá)的腫瘤抗原的水平，腫瘤負(fù)荷，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浒斜砦坏挠H和力，以及CAR的共刺激結(jié)構(gòu)域。因此，在優(yōu)化治療效果和限制毒性方面，仔細(xì)考慮CAR的模塊化結(jié)構(gòu)的幾個組成部分是必要的。

（1）改變CAR結(jié)構(gòu)。降低毒性的一個途徑是通過改變CAR-T細(xì)胞的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和力。降低抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和力預(yù)計將導(dǎo)致對腫瘤細(xì)胞表面上更高的抗原密度的要求增加，以實現(xiàn)高水平的激活。因此，預(yù)計下降的抗原親和力將規(guī)避對具有相對較低抗原量的健康組織的靶向。探究這一原理的研究表明，與具有低納摩爾/亞納摩爾親和力的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相比，具有微摩爾親和力的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)哂休^高水平的靶抗原表達(dá)的腫瘤的選擇性要高得多。

人們也有可能通過通過修飾活化的CAR-T細(xì)胞的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)來調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌。例如，在靶向CD19的CAR中，修飾CD8-α衍生的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)氨基酸序列可導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放水平降低，CAR-T細(xì)胞增殖減少。優(yōu)化鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)可能是一個有用的方法來降低毒性，因為在1期臨床試驗中，這些在鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)發(fā)生修飾的CAR導(dǎo)致54.5％的B細(xì)胞淋巴瘤患者（6/11名患者）完全緩解，重要的是，沒有級別>1的CRS或ICANS事件發(fā)生。

共刺激結(jié)構(gòu)域在CAR設(shè)計中提供了另一個可修飾的區(qū)域，該區(qū)域可以根據(jù)腫瘤類型、腫瘤負(fù)荷、抗原密度、靶抗原-抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)σ约皾撛诘亩靖弊饔眠M(jìn)行定制。具體來說，4-1BB結(jié)構(gòu)域?qū)е螺^低的毒性風(fēng)險，較高的T細(xì)胞耐久性，以及較低的T細(xì)胞增殖峰值水平，而CD28共刺激結(jié)構(gòu)域與CAR-T細(xì)胞活性有關(guān)，該活性的起始和隨后的衰竭更為迅速。因此，產(chǎn)生較小毒性的4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域在高疾病負(fù)擔(dān)和/或高抗原密度的腫瘤的情況下可能特別有用，而CD28共刺激結(jié)構(gòu)域可能是在總表面抗原密度較低和/或具有低親和力抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CAR的情況下達(dá)到所需的T細(xì)胞活化閾值所需要的。

（2）降低免疫原性。宿主免疫系統(tǒng)對CAR構(gòu)建體的識別可能促進(jìn)細(xì)胞因子相關(guān)的毒性，因此，利用人類或人源化抗體片段代替鼠源CAR來降低CAR的免疫原性可能是有利的。此外，鉸鏈區(qū)和/或跨膜結(jié)構(gòu)域可以被修改，以降低CAR的免疫原性，而且有趣的是，CAR-T細(xì)胞的持久性得到改善。

（3）修改CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞，降低神經(jīng)毒性。一個令人興奮的最近開發(fā)的防止CAR-T細(xì)胞細(xì)胞因子毒性的途徑是基于對CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞進(jìn)行修飾。細(xì)胞因子和髓樣細(xì)胞似乎在CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中起著重要作用，因為有報道顯示，在3級或更高的神經(jīng)毒性患者中CD14+細(xì)胞顯著增加，而且一項關(guān)鍵的針對大B細(xì)胞淋巴瘤的CAR-T細(xì)胞臨床試驗表明，在與3級或更高的神經(jīng)毒性產(chǎn)生相關(guān)的血清生物標(biāo)志物中，GM-CSF升高與神經(jīng)毒性最顯著相關(guān)。最近的臨床前研究表明，在用lenzilumab抑制活化巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的細(xì)胞因子GM-CSF后，神經(jīng)毒性和CRS減少，CAR-T細(xì)胞活性增加。GM-CSF突變失活在CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞中似乎也有類似的效果。

因此，這些研究結(jié)果表明，GM-CSF中和有助于減少神經(jīng)毒性和減少CRS。此外，以髓樣細(xì)胞特異性的方式剔除酪氨酸羥化酶或使用甲酪氨酸抑制這種酶，導(dǎo)致兒茶酚胺和細(xì)胞因子水平下降。臨床前證據(jù)還表明，IL-1受體拮抗劑減少了用靶向CD19的CAR-T細(xì)胞治療的白血病/淋巴瘤小鼠模型中的一種神經(jīng)炎癥形式。

（4）CAR“關(guān)閉開關(guān)”。緩解CAR-T細(xì)胞毒性的另一個潛在途徑是通過實施“關(guān)閉開關(guān)”或自殺基因策略。這樣的策略將有助于在不良事件發(fā)生時通過二級誘導(dǎo)劑處理選擇性減少經(jīng)過基因改造的細(xì)胞。利用這些概念的幾種方法已被開發(fā)。比如，獨(dú)立表達(dá)全長CD20或CD20模擬表位或經(jīng)過基因改造后表達(dá)全長CD20或CD20模擬表位的CAR構(gòu)建體促進(jìn)通過利妥昔單抗處理剔除CAR-T細(xì)胞。然而，這種方法的一個局限性是抗體介導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞剔除的相對緩慢的發(fā)生，這可能會限制這種方法在嚴(yán)重的急性細(xì)胞因子介導(dǎo)的毒性期間需要立即逆轉(zhuǎn)這種毒性的患者中的療效。這促使人們開發(fā)出更快的開關(guān)，如誘導(dǎo)性cas9。在一項臨床試驗中，誘導(dǎo)性cas9在30分鐘內(nèi)消除了90%以上經(jīng)過基因改造的T細(xì)胞。

其他策略依賴于基于蛋白酶的小分子輔助關(guān)閉CAR（SMASh-CAR），這也被稱為關(guān)閉開關(guān)CAR（SWIFF-CAR）。自殺策略或其他類似方法的最大局限性是，盡管它們對確保安全性很有吸引力，但它們的使用會突然停止對快速進(jìn)展的疾病的治療。這一限制已經(jīng)成為一種強(qiáng)大的動機(jī)，促使人們制定策略來確保安全性，而自殺基因激活則是最后的手段。一種具有令人興奮的潛力的方法涉及使用酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼，其功能是通過抑制近端TCR信號激酶來抑制T細(xì)胞的激活。在臨床前模型中，達(dá)沙替尼快速且可逆地阻止CAR-T細(xì)胞的激活，并且在CAR-T細(xì)胞輸注后早期給予達(dá)沙替尼的結(jié)果是顯著降低小鼠因致命性CRS出現(xiàn)的死亡率。因此，這種方法似乎提供了對CAR-T細(xì)胞功能的暫時性抑制，并且可以允許在毒性消退后挽救CAR-T細(xì)胞療法。未來，開發(fā)暫時抑制CAR-T細(xì)胞功能并在毒性消退后允許CAR-T細(xì)胞療法挽救的額外創(chuàng)新方法將是CAR-T細(xì)胞治療邁向血液惡性腫瘤和實體瘤一線治療的必要條件。

結(jié)論

CAR是一種模塊化的合成受體，主要由四個部分組成：一個細(xì)胞外靶抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個鉸鏈區(qū)、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個或多個細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。CAR-T細(xì)胞已經(jīng)徹底改變了某些血液惡性腫瘤的治療。然而，仍然存在障礙。對技術(shù)人員進(jìn)行培訓(xùn)使之滿足這個復(fù)雜和不斷發(fā)展的領(lǐng)域的需求是具有挑戰(zhàn)性的，需要開發(fā)創(chuàng)新的課程。抗原選擇對CAR-T細(xì)胞功能至關(guān)重要。由于CAR-T細(xì)胞的選擇性壓力，腫瘤細(xì)胞可以下調(diào)抗原表達(dá)。即使有適當(dāng)?shù)目乖邢?，脫靶效?yīng)也會發(fā)生，并引起相關(guān)的毒性。在實體瘤中，讓CAR-T細(xì)胞遷移到腫瘤并浸潤腫瘤是一大挑戰(zhàn)。惡性腫瘤的免疫抑制性微環(huán)境會加劇這一障礙。有效的治療也會導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞相關(guān)毒性（比如CRS和神經(jīng)毒性）的風(fēng)險。然而，雖然存在挑戰(zhàn)，但新的策略和潛在的解決方案仍在不斷發(fā)展，并且可能為未來更有效和更安全的治療提供一條道路。（生物谷 Bioon.com）

小編推薦會議  2021（第十二屆）細(xì)胞治療線上國際研討會

http://meeting.bioon.com/2021cell-therapies