applied DNA Sciences子公司LineaRx通過(guò)專有的非病毒、無(wú)質(zhì)粒平臺(tái)（non-viral， plasmid-free ；NVPF）在人類CAR-T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)抗CD19表達(dá)，開(kāi)創(chuàng)新一代更快、更經(jīng)濟(jì)的細(xì)胞治療藥物。

據(jù)該公司所知，這一開(kāi)創(chuàng)性的事件首次表明人類T細(xì)胞利用可擴(kuò)展PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）制造工藝生產(chǎn)的線性DNA從基因構(gòu)建體表達(dá)抗CD19 CAR。該公司將這一進(jìn)展視為目前所有使用病毒遞送平臺(tái)基因療法的一個(gè)重要選擇，尤其是使用病毒傳遞合成基因來(lái)重定向患者T細(xì)胞的免疫腫瘤療法，即CAR療法。

LineaRx獨(dú)特的PCR的制造技術(shù)創(chuàng)造了編碼抗CD19銜接器的線性DNA擴(kuò)增子，然后將該構(gòu)建體通過(guò)離體電穿孔到人T細(xì)胞中，隨后的測(cè)試顯示從這些工程細(xì)胞中產(chǎn)生抗CD19表達(dá)。雖然這些初步數(shù)據(jù)令人鼓舞，但總體表達(dá)水平最初較低，LineaRx將繼續(xù)致力于使用正在申請(qǐng)專利的高表達(dá)擴(kuò)增子（HEA？）和除電穿孔以外的轉(zhuǎn)染方法產(chǎn)生更高的轉(zhuǎn)染水平，并將報(bào)告這一重大成就的進(jìn)一步進(jìn)展。

如立體模式圖顯示，當(dāng)細(xì)胞通過(guò)“電轉(zhuǎn)區(qū)”時(shí)，施加脈沖，電場(chǎng)線通常不將絕緣的細(xì)胞穿透，而是通過(guò)導(dǎo)電孔穿過(guò)細(xì)胞。

目前，電穿孔技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)、基因工程、臨床醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。比如，利用電穿孔實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染、細(xì)胞融合、將外源蛋白質(zhì)分子插入細(xì)胞膜、激活細(xì)胞膜的傳輸因子、提高酶的活性、提高藥物進(jìn)入細(xì)胞的能力、以及增強(qiáng)癌癥的化療效果等。

成功的細(xì)胞轉(zhuǎn)染關(guān)系到眾多生物醫(yī)學(xué)研究以及生物產(chǎn)業(yè)鏈，包括細(xì)胞療法、RNA干擾、以及干細(xì)胞研究。非病毒方法的外源載體轉(zhuǎn)染技術(shù)面臨的主要挑戰(zhàn)在于不夠穩(wěn)定的、低下的轉(zhuǎn)化效率，尤其是原代細(xì)胞系、干細(xì)胞系這類難轉(zhuǎn)株。電穿孔技術(shù)的一個(gè)傳統(tǒng)瓶頸在于，如何以不犧牲細(xì)胞生存能力為前提，取得高效的轉(zhuǎn)化率。成功的電轉(zhuǎn)技術(shù)涉及了電場(chǎng)、緩沖參數(shù)等方方面面的優(yōu)化，需要考慮到不同的細(xì)胞系、分子負(fù)載等，以達(dá)到轉(zhuǎn)化效率和細(xì)胞損傷量的理想平衡。如此而來(lái)，一個(gè)成功的電轉(zhuǎn)技術(shù)的可能經(jīng)歷過(guò)反復(fù)失敗，并且很可能在另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)室或另一項(xiàng)應(yīng)用中將無(wú)法重復(fù)。

這一成就建立在另一個(gè)第一個(gè)工程人類T細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過(guò)線性DNA擴(kuò)增子在2018年末通過(guò)LineaRx的PCR技術(shù)生產(chǎn)、設(shè)計(jì)和制造，證明了一個(gè)線性DNA擴(kuò)增子，其中含有編碼綠色熒光蛋白產(chǎn)生的完整基因（GFP），如在顯微鏡圖像中所見(jiàn)，通過(guò)高通量電穿孔促進(jìn)了PCR產(chǎn)生的GFP基因片段在數(shù)百個(gè)人T細(xì)胞中的攝取和隨后表達(dá)，產(chǎn)生了綠色熒光細(xì)胞的亮點(diǎn)。

LineaRx認(rèn)為NVPF CAR-T制造平臺(tái)比現(xiàn)有的基于病毒/質(zhì)粒的CAR-T平臺(tái)具有許多潛在優(yōu)勢(shì)，包括：

簡(jiǎn)化的生產(chǎn)流程將降低成本和縮短交貨時(shí)間，通過(guò)縮短“靜脈對(duì)靜脈”的時(shí)間減少病人的發(fā)病率和死亡率。

降低永久性遺傳整合/重組進(jìn)入靶細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)，降低插入誘變的風(fēng)險(xiǎn)

目前一些CAR-T細(xì)胞治療副作用的潛在緩解，如細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和靶向腫瘤外毒性

靶向新抗原的最終能力（足以快速影響患者）或個(gè)體患者癌癥中產(chǎn)生的特異性蛋白質(zhì)突變，以及癌癥以外的其他疾病表現(xiàn)，這將使患者的免疫系統(tǒng)成為多種治療手段的工具

最終能夠在護(hù)理點(diǎn)開(kāi)發(fā)CAR-T療法，避免復(fù)雜和繁瑣的供應(yīng)鏈，從而加速治療

applied DNA總裁兼首席執(zhí)行官James A. Hayward博士表示： “我們的目標(biāo)有三個(gè)方面：1）作為快速設(shè)計(jì)和生產(chǎn)治療性核酸構(gòu)建體的平臺(tái)，建立包括在護(hù)理點(diǎn)的PCR產(chǎn)生的線性DNA的價(jià)值； 2）證明不同于全行業(yè)病毒生產(chǎn)的NVPF生產(chǎn)流程具有更高的安全性和治療價(jià)值；3)與未來(lái)的合作伙伴將我們基于NVPF的抗CD19 CAR T細(xì)胞治療帶到臨床?！?/p>

2018年10月，LineaRx宣布與iCell基因治療公司簽署了一項(xiàng)北美獨(dú)家授權(quán)和研究服務(wù)協(xié)議，用于抗CD19 CAR-T治療的研究。LineaRx利用applied DNA在大規(guī)模PCR生產(chǎn)和DNA化學(xué)修飾方面的專長(zhǎng)及其N(xiāo)VPF平臺(tái)開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)CAR-T治療的表達(dá)載體，包括其非病毒、無(wú)質(zhì)?？笴D19 CAR-T候選藥物L(fēng)inCART19？。

在不使用病毒載體或質(zhì)粒的情況下，LineaRx的NVPF制造平臺(tái)與現(xiàn)有的基于病毒/質(zhì)粒的CAR-T方法相比具有許多潛在優(yōu)勢(shì)，若成功則可以為患者提供了更高效，更實(shí)惠和更安全的基因療法。

目前，這些初步數(shù)據(jù)令人鼓舞，但總體表達(dá)水平最初較低，LineaRx將繼續(xù)致力于使用正在申請(qǐng)專利的高表達(dá)擴(kuò)增子（HEA？）和除電穿孔以外的轉(zhuǎn)染方法產(chǎn)生更高的轉(zhuǎn)染水平，并將報(bào)告這一重大成就的進(jìn)一步進(jìn)展。

未來(lái)，該公司是否能實(shí)現(xiàn)比現(xiàn)有的基于病毒/質(zhì)粒的CAR-T平臺(tái)的潛在優(yōu)勢(shì)，我們拭目以待！(世聯(lián)博研(Bioexcellence)世聯(lián)博研Bioexcellence）

小編推薦會(huì)議 2019（第十屆）細(xì)胞治療國(guó)際研討會(huì)

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